對于內(nèi)徑比較小的柱子，樣品大小應(yīng)該減少至與柱子直徑的平方成正比。如果樣品中包含可電離的分子，樣品量＞1μg就會出現(xiàn)柱子超載的現(xiàn)象。

     樣品進(jìn)樣量對HPLC分離效果影響基于以下原因：

• 為了避免由于樣品進(jìn)樣量太大，而在分離中出現(xiàn)不想要的變化；

• 為了增加痕量分析中檢測器的敏感度需要使用盡可能大的樣品進(jìn)樣量；

• 為了在制備HPLC中大化回收凈化后的產(chǎn)品量。

  
  

     由于樣品的進(jìn)樣體積或進(jìn)樣量太大而造成的分離度和（或）保留時間的變化，分別稱為體積超載和質(zhì)量超載。

     體積超載：樣品體積對分離效果的影響。

     假設(shè)樣品中的分子濃度保持不變，樣品體積對峰的尺寸和形狀的影響如下圖所示，隨著樣品的進(jìn)樣體積按照進(jìn)樣順序1~4不斷增加，色譜峰開始逐漸加寬，然后形成一個平扁的頂部。

    幾種不同的色譜柱構(gòu)造，它們的最大樣品進(jìn)樣體積如下：

(150mmx4.6mm，3μm顆粒）Vs≤80μL

(100mmx4.6mm，3μm顆粒）Vs≤50μL

(30mmx4.6mm，3μm顆粒）Vs≤30μL

(30mmx2.1mm，1.5μm顆粒）Vs≤4μL。

     如果色譜圖中較早洗脫出來的峰的分離度并不是關(guān)鍵，那么就可以進(jìn)樣較大體積的樣品。

     樣品可能溶解在某種溶劑的溶液中而不是在流動相里。當(dāng)樣品溶劑比流動相要弱時，可以進(jìn)樣體積較大的樣品而不會對峰寬和分離度造成負(fù)面影響。相反，進(jìn)樣溶解在比流動相強的溶劑里的樣品，往往會使得色譜圖中較早洗脫出來的色譜峰發(fā)生譜帶加寬和（或）扭曲變形。用比流動相強的溶劑來配備樣品是一種常見的錯誤， 如果有可能應(yīng)該盡量避免。如果不方便更換樣品溶劑，那么雖然樣品溶解在較強的溶劑里， 但是只要進(jìn)樣體積夠小，色譜圖就不會受到影響（可以忍受）。

     以1:1的比例用較弱的A溶劑（比如水）稀釋樣品，然后以2倍的體積進(jìn)樣。這樣做能有效地減少樣品溶劑帶來的問題（尤其是當(dāng)一個樣品溶劑＞50%B) ，而同時也能保持進(jìn)樣的樣品量不變。較大的進(jìn)樣體積和較強的樣品溶劑可以在梯度洗脫法里使用，因為在梯度洗脫開始的時候樣品會和較弱的流動相（較低的％B ）混合。如果有疑問，那么將進(jìn)樣體積減小為原來的一半以及增加為原來的2 倍，并且觀察不同的進(jìn)樣體積對分離度的影響，接著再根據(jù)相應(yīng)的情況作進(jìn)一步調(diào)整。

      質(zhì)量超載：樣品重量對分離效果的影響。

     即便樣品的進(jìn)樣體積較小，溶解樣品的質(zhì)量也會有可能導(dǎo)致色譜柱超載，造成樣品峰的加寬和變形。這種情況的發(fā)生是因為柱子保留樣品分子的容量是有限的；也就是說靠近峰帶的固定相中樣品飽和。下圖顯示的是一個由于柱子超載而造成的譜帶加寬的例子。樣品進(jìn)樣量的大小順序為1a<1b<1c<1d<2<3<4（最大進(jìn)樣量）。

     只要樣品中各個成分的重量不要過多（ 通常對于4.6mm內(nèi)徑的柱子進(jìn)樣量<50μg ，內(nèi)徑小的柱子，進(jìn)樣量也相應(yīng)要減少），每個峰帶在柱子內(nèi)的移動就不會受到樣品中其他峰帶的影響。因此，樣品中單個化合物的重量，往往決定了色譜柱是否會超載，峰形是否會發(fā)生改變，而與樣品總重量無關(guān)。其中一個化合物引起色譜柱的超載，也不會影響到樣品中其他色譜峰的分離（只要它們都是基線分離的）。只有當(dāng)單個化合物的進(jìn)樣量太大，才會發(fā)生色譜柱超載的現(xiàn)象并同時出現(xiàn)色譜峰的拖尾（ 比如對于內(nèi)徑為4.6mm 的柱子進(jìn)樣量＞50μg)。

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